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　　冷冻保存细胞之方法？冷冻保存方法一:冷冻管置于4℃30~60分钟→（-20℃30分钟*）→ -80℃16~18小时（或隔夜）→液氮槽vaporphase长期储存。冷冻保存方法二:冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3℃至–80℃以下，再放入液氮槽vapor phase长期储存。*-20℃不可超过1小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。产品属性：

　　背景描述KG-1细胞是由H·P·Koeffler和D·W·Golde建立，骨髓抽自一个59岁的患有红白血病而后又发展成急性骨髓原性白血病的男性白人。KG1细胞在形态上类似急性髓原白血病kb体育，表现为明显的多形性，骨髓母细胞和骨髓细胞占优势。KG1细胞少量是成熟的粒细胞，也有微量的巨噬细胞和嗜曙红细胞。

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　　实验要点及说明：1．本方法适用于贴壁细胞培养，而不适用于悬浮细胞培养，悬浮细胞可使用滴片法；2．所使用的盖玻片应该为优质玻璃制造，并经过铬酸洗液处理；3．盖玻片非常薄，易碎，取放盖玻片时动作要轻；产品仅用于科研4．如果需要更多生长状态一致的细胞，可以使用较大的培养皿，但不宜过大，以避免培养液的浪费和增加污染机率；5．如果细胞贴壁生长能力较差，可将盖玻片在0.5%多聚赖氨酸溶液中浸泡5-10分钟并自然晾干。实验报告：一、分离与培养：1、无菌条件下，取出1-3d龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次，将组织剪成1mm3左右大小；2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1%和0.1% I型胶原酶），混悬10s，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织完全被消化；4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min离心10min，弃去上清，沉淀细胞用含有10％FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃，5％CO2培养箱中培养；5、差速贴壁1h后，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养；二、免疫荧光鉴定：1、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；2、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；3、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min；4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜；5、PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗，37℃条件下放置1h；6、用PBS冲洗3次，每次10min，在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。

　　培养操作:1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落kb体育，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。4.将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为类；1.细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。2. 4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%KB新闻，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。3.将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

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